Złote kompleksy – nowa nadzieja w walce z biofilmami bakteryjnymi

Czy złote kompleksy to nowa era w leczeniu biofilmów?

Złote kompleksy w walce z biofilmami bakteryjnymi – nowa nadzieja w leczeniu opornych zakażeń stafilokokowych

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi obecnie jedno z największych wyzwań współczesnej medycyny, wiążąc się z wysokim ryzykiem niepowodzenia terapii i nawrotów zakażeń. Kryzys związany z opornością na antybiotyki przypisuje się głównie nadużywaniu i niewłaściwemu stosowaniu środków przeciwbakteryjnych, co doprowadziło do selekcji niewrażliwych klonów bakteryjnych. Dodatkowo, brak rozwoju nowych leków przeciwdrobnoustrojowych przez przemysł farmaceutyczny z powodu zmniejszonych zachęt ekonomicznych prowadzi do okresu, w którym wybory antybakteryjne mogą być niezwykle ograniczone. Szczególnie alarmujący jest udział biofilmów bakteryjnych w tym procesie – biofilmy stafilokokowe uczestniczą w około 80% zakażeń przewlekłych i odgrywają główną rolę w 60% wszystkich ludzkich zakażeń bakteryjnych. Bakterie rosnące w biofilmie mogą tolerować stężenia środków przeciwdrobnoustrojowych nawet 1000 razy wyższe niż ich planktonowe odpowiedniki, co czyni infekcje związane z biofilmem niezwykle trudnymi do leczenia.

Jak działają złote kompleksy i co sprawia, że są wyjątkowe?

W tym kontekście, kompleksy na bazie złota, zwłaszcza złota (I) i złota (III), wyłaniają się jako obiecująca klasa związków zdolnych do skutecznego zwalczania zakażeń bakteryjnych. Auranofin (AF) – związek złota(I) zawierający trietylofosfan i tetraoctan tioglukozy jako ligandy – wykazuje wysoką skuteczność przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, w tym opornym na wiele leków, takim jak Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium i Enterococcus faecalis, jednocześnie wykazując niską aktywność wobec szczepów Gram-ujemnych. Pierwotnie zatwierdzony w 1985 roku przez FDA jako lek pierwszego rzutu w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, AF jest obecnie szeroko wykorzystywany w leczeniu przeciwnowotworowym, przeciwbakteryjnym, przeciwwirusowym i przeciwpasożytniczym.

Działanie farmakologiczne AF przypisuje się kationowi [AuPEt₃]⁺, uważanemu za prawdziwy farmakofor, który powstaje po uwolnieniu części tiosacharydu w środowisku biologicznym. Wysokie powinowactwo złota(I) do tioli i selenoli sprawia, że ten lek i jego pochodne mogą silnie oddziaływać z białkami zawierającymi takie grupy, upośledzając kluczowe szlaki niezbędne do przeżycia komórki. Udowodniono, że AF i jego analogi mogą hamować wzrost pasożytów, bakterii i komórek nowotworowych poprzez celowanie w reduktazę tioredoksyny (TrxR), powodując akumulację reaktywnych form tlenu (ROS) wewnątrz komórki i ostatecznie indukując jej śmierć. Eksperymenty oparte na spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości wykazały, że fragment [AuPEt₃]⁺ może wiązać się z grupami cysteiny i selenocysteiny obecnymi w syntetycznym peptydzie naśladującym redoks-aktywne miejsce reduktazy tioredoksyny. Ponadto, wykazano, że AF może reagować i tworzyć stabilny kompleks z rodnikami hydroselenylowymi (HSe⁻), które są kluczowymi cząsteczkami dla syntezy selenoprotein, co może prowadzić do zmniejszenia puli selenu dostępnego dla komórek.

Biorąc pod uwagę potwierdzoną aktywność biologiczną AF, jego koniugacja z różnymi cząsteczkami może poprawić jego działanie przeciwbakteryjne, zapewniając nowe właściwości farmakologiczne o zwiększonej skuteczności i/lub efektach synergistycznych. Wykazano na przykład, że koniugacja AF z N-acetylocysteiną, cząsteczką o właściwościach przeciwzapalnych, wykazywała aktywność przeciwbiofilmową. N-acetylocysteina jest przydatna w leczeniu zakażeń przewlekłych, charakteryzujących się wysokim poziomem miejscowego stanu zapalnego. Została ona uwzględniona na Liście Podstawowych Leków Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) i jest stosowana w różnych terapiach zaburzeń, takich jak mukowiscydoza, przewlekła obturacyjna choroba płuc, przewlekłe zapalenie oskrzeli i kilka innych. Inną alternatywną cząsteczką, którą można wykorzystać do koniugacji AF, jest naproksen, który jest lekiem przeciwzapalnym należącym do grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), wykazującym właściwości przeciwbólowe i przeciwgorączkowe.

Co nowego w syntezie i stabilności derivatów AF?

W najnowszych badaniach naukowcy skoncentrowali się na ocenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej AF i dwóch jego analogów skoniugowanych z naproksenem (AF-Napx) lub acetylocysteiną (AF-AcCys) wobec biofilmów S. aureus i S. epidermidis in vitro. Nowy kompleks złota(I) zawierający fragment [AuPEt₃]⁺ związany z naproksenem został zsyntetyzowany i scharakteryzowany za pomocą spektroskopii NMR ¹H, ³¹P, ¹³C, spektrometrii masowej (HR-ESI-MS) i analizy elementarnej. Związek otrzymano przez transmetalację, poddając reakcji Et₃PAuCl z solą srebrową naproksenu. Ta strategia syntetyczna została już z powodzeniem zastosowana do otrzymania podobnych kompleksów karboksylanów złota(I).

Stabilność AF-Napx była oceniana zarówno za pomocą spektroskopii UV-Vis, jak i eksperymentów ³¹P{¹H}-NMR w mieszaninie DMSO/H₂O (6:4). Profil spektralny UV-Vis kompleksu AF-Napx nie wykazał znaczących zmian, potwierdzając jego stabilność w mieszaninie rozpuszczalnika organicznego i wody. Co istotne, procent degradacji był minimalny, o wartości 3,4% po 48 godzinach. Podobnie, stabilność w tej samej mieszaninie (DMSO/H₂O) została spektrofotometrycznie oceniona dla AF-AcCys, również wykazując stabilność w tym samym 48-godzinnym okresie, z procentem degradacji wynoszącym 2,1%.

Lipofilowość AF-Napx została oceniona poprzez pomiar współczynnika podziału oktanol-woda wyrażonego jako LogP. Lipofilowość jest ważnym parametrem fizykochemicznym, ponieważ jest związana z przepuszczalnością błony, wchłanianiem leku i dystrybucją. Wartość LogP zmierzona dla AF-Napx wynosiła 1,25 ± 0,22, wskazując na lipofilowy charakter kompleksu. Ta wartość plasuje AF-Napx pomiędzy AF-AcCys (LogP = -0,95) a AF (LogP = 1,60) na skali lipofilowości, ale z większym podobieństwem do leku macierzystego.

Jak potwierdzona jest aktywność przeciwbakteryjna kompleksów AF?

Badania wykazały, że AF był aktywny przeciwko gronkowcom w stężeniach niecytotoksycznych. Komórki A549 poddane działaniu AF wykazały nieznaczne zmniejszenie żywotności komórek przy zwiększonych stężeniach AF, jednak nie zaobserwowano istotnej różnicy do 8 μM w porównaniu z kontrolą negatywną. Natomiast komórki poddane działaniu 16 μM AF wykazały znaczne zmniejszenie żywotności (80%) (p ≤ 0,05). Ekspozycja komórek na AF-Napx i AF-AcCys nie wykazała żadnego efektu cytotoksycznego, co potwierdzono przez procent żywotności. “Nasze badania cytotoksyczności potwierdzają, że modyfikacja auranofinu poprzez koniugację z innymi związkami bioaktywnymi może zmniejszyć jego potencjalne działania niepożądane” – piszą autorzy badania.

Wartości MIC (minimalne stężenie hamujące) AF przeciwko S. aureus wahały się od 2 do 0,25 µM, potwierdzając wcześniejsze badania. Lek był aktywny przy najniższym testowanym stężeniu wobec S. epidermidis (wartości MIC ≤ 0,12 µM), co można wyjaśnić właściwościami fizykochemicznymi testowanych cząsteczek, w tym wartościami LogP. AF jest najbardziej lipofilowym związkiem z testowanego panelu, co może pozwalać na wyższą aktywność wobec S. epidermidis, który ma bardziej hydrofobową powierzchnię ze względu na strukturę chemiczną ściany komórkowej.

Koniugacja acetylocysteiny z AF determinowała wartości MIC podobne do samego AF dla izolatów S. aureus, podczas gdy dla szczepów S. epidermidis uzyskano wyższe wartości (2 lub >2 μM). AF-Napx wykazywał wartości MIC w zakresie od 2 do 0,25 μM dla wszystkich testowanych szczepów. Co ciekawe, wartości MIC obserwowane dla AF (najbardziej lipofilowego testowanego związku) były niższe niż dla AF-AcCys i AF-Napx w większości przypadków.

Czy te nowe związki mogą być skuteczne przeciwko bakteriom tworzącym biofilm? Badania wykazały, że aktywność przeciw gronkowcom AF była zachowana wobec bakterii osadzonych w biofilmie, zarówno w S. aureus, jak i w S. epidermidis, przy niecytotoksycznych stężeniach. Wartości MBBC (minimalne stężenie bakteriobójcze dla biofilmu) i MBEC (minimalne stężenie eradykujące biofilm) dla AF wahały się od 8 do 0,5 μM dla szczepów S. aureus, z wyjątkiem S. aureus 12, którego MBEC wynosił >8 μM. W przypadku izolatów klinicznych S. epidermidis, wartości MBBC i MBEC wahały się od 8 do 2 μM.

W przypadku AF-AcCys, wartości MBBC i MBEC wynosiły >8 lub 8 μM dla wszystkich izolatów gronkowcowych, z wyjątkiem MBBC S. aureus 12, który wynosił 4 μM. Wartości MBBC dla AF-Napx wynosiły 8 μM dla izolatów S. aureus, z wyjątkiem S. aureus 11 (>8 μM), podczas gdy wartości MBEC wynosiły >8 μM dla wszystkich testowanych szczepów S. aureus. W przypadku izolatów S. epidermidis, wartości MBBC i MBEC dla AF-Napx były niższe (w zakresie od 2 do 1 μM) w porównaniu ze szczepami S. aureus.

Badania mikroskopowe SEM potwierdziły te wyniki, pokazując wyraźne różnice ultrastrukturalne w komórkach bakteryjnych poddanych działaniu AF i jego pochodnych. Próbki biofilmu, użyte jako kontrola niepoddana działaniu (Rysunki 4A i 5A), charakteryzowały się komórkami bakteryjnymi w kształcie kokoidalnym, przylegającymi do siebie i do podłoża szklanego. Ekspozycja bakterii na AF (Rysunki 4B i 5B) prowadziła do uszkodzenia komórek, powodując zmiany morfologiczne i całkowitą lizę obu gatunków bakterii. Podobny stan zaobserwowano, gdy biofilmy S. aureus i S. epidermidis były traktowane AF-Napx (Rysunki 4D i 5D), chociaż efekt bakteriobójczy był bardziej widoczny w S. epidermidis, gdzie morfologia komórek sugerowała zabijanie bakterii. Co ciekawe, w wyniku leczenia biofilmu za pomocą AF-AcCys, utworzył się cienki film pokrywający komórki bakteryjne zarówno w S. aureus, jak i S. epidermidis (Rysunki 4C i 5C).

Co ciekawe, analizy teoretyczne potwierdziły, że fragmentacja kompleksów zapewniająca uwolnienie [AuPEt₃]⁺ jest najłatwiejsza w przypadku AF-Napx (najniższy koszt energetyczny), co koreluje z najwyższą aktywnością antybiofilową. Badacze wykorzystali podejścia DFT do zbadania fragmentacji trzech pochodnych auranofinu składających się z aktywnej części [AuPEt₃]⁺ i części nośnikowej, tj. Napx, tiocukru lub AcCys. Obliczone wartości energii fragmentacji (FE), energii dysocjacji wiązań (BDE) i swobodnej energii dysocjacji wiązań (BDFE) wykazały ten sam trend, wykazując, że uwolnienie kationowego kompleksu [AuPEt₃]⁺ z AF-Napx ma najniższy koszt energetyczny, podczas gdy najwyższy koszt energetyczny stwierdzono w przypadku AF-AcCys. “Nasze obliczenia pokazują, że korzystniejsze uwalnianie kationu [AuPEt₃]⁺ z kompleksu naproksenu jest spowodowane słabszym wiązaniem O-Au(I) w tym gatunku w porównaniu z silniejszym wiązaniem S-Au(I) zarówno w AF, jak i AF-AcCys” – wyjaśniają badacze.

Jakie perspektywy kliniczne otwierają te badania?

Jakie są zatem implikacje kliniczne tych odkryć? Wzrastająca oporność na antybiotyki i trudności w leczeniu infekcji związanych z biofilmem wymagają nowych strategii terapeutycznych. W 2021 roku przewidywano, że 4,71 miliona zgonów będzie związanych z bakteryjną opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Wśród głównych patogenów, których przypisywalne zgony są związane z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe, oporny na metycylinę S. aureus jest uwzględniony na liście priorytetowej WHO, dla której potrzebne są nowe rozwiązania przeciwdrobnoustrojowe.

Repurposing AF oraz jego pochodnych jako innowacyjnych leków antybakteryjnych, szczególnie w przypadkach zakażeń związanych z biofilmami i urządzeniami medycznymi (np. cewniki, implanty), może stanowić obiecującą alternatywę. Mniejsza cytotoksyczność pochodnych (szczególnie AF-Napx) przy zachowaniu skuteczności antybakteryjnej otwiera możliwość dłuższego stosowania przy minimalnych efektach ubocznych. Należy zauważyć, że AF jest obecnie zatwierdzony do długoterminowego leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, a pacjenci stosują lek codziennie w dawce 6 mg/dzień przez ponad 5 lat, co jest znacznie dłuższe niż standardowy schemat antybiotykowy trwający 1-2 tygodnie. W związku z tym, każda toksyczność związana z AF nie powinna stanowić głównej przeszkody w jego przekształceniu w nowy lek przeciwbakteryjny do leczenia zakażeń gronkowcowych.

Podsumowując, AF może być stosowany w leczeniu zakażeń bakteryjnych związanych z biofilmem. Ponadto, AF skoniugowany z naproksenem może być stosowany w przypadku biofilmów S. epidermidis, szczególnie w leczeniu zakażeń związanych z urządzeniami medycznymi, gdzie obecne są zarówno infekcja, jak i stan zapalny. Czy te obiecujące wyniki laboratoryjne przełożą się na skuteczne terapie kliniczne? Odpowiedź na to pytanie wymaga dalszych badań, ale pierwsze rezultaty dają nadzieję na nowe rozwiązania w walce z opornymi zakażeniami stafilokokowymi.

Podsumowanie

Badania wykazały wysoką skuteczność auranofinu (AF) i jego pochodnych w zwalczaniu biofilmów bakteryjnych, szczególnie szczepów Staphylococcus. AF wykazuje aktywność przeciwbakteryjną w stężeniach niecytotoksycznych, z wartościami MIC od 2 do 0,25 µM dla S. aureus i ≤ 0,12 µM dla S. epidermidis. Koniugacja AF z naproksenem (AF-Napx) i N-acetylocysteiną (AF-AcCys) zachowuje aktywność przeciwbakteryjną przy zmniejszonej toksyczności. Szczególnie obiecujące wyniki uzyskano dla AF-Napx w przypadku biofilmów S. epidermidis. Badania mikroskopowe SEM potwierdziły skuteczność związków w niszczeniu struktury biofilmu. Wyniki sugerują potencjalne zastosowanie kliniczne, zwłaszcza w leczeniu zakażeń związanych z urządzeniami medycznymi.

Bibliografia

Ferretti Caterina, Chiaverini Lorenzo, Poma Noemi, Dalli Andrea, Di Leo Riccardo, Rindi Laura, Marrone Alessandro, Tolbatov Iogann, La Mendola Diego, Tavanti Arianna, Marzo Tiziano and Di Luca Mariagrazia. Antimicrobial and Antibiofilm Activity of Auranofin and Its Two Derivatives Bearing Naproxen and Acetylcysteine as Ligands Against Staphylococci †. Antibiotics 2025, 14(2), e51034-283. DOI: https://doi.org/10.3390/antibiotics14020118.