Czy osteoartretyzm wymaga nowatorskich strategii terapeutycznych?
Osteoartretyzm (OA) jest powszechnie występującą chorobą zwyrodnieniową stawów, charakteryzującą się apoptozą chondrocytów, uszkodzeniem błony maziowej, zwężeniem przestrzeni stawowych i tworzeniem osteofitów. Wraz ze starzeniem się populacji i rosnącym wskaźnikiem otyłości, częstość występowania OA wzrasta globalnie, szczególnie w Chinach, gdzie pierwotny OA dotyka do 46,3% dorosłych powyżej 40. roku życia. OA powoduje znaczący ból, dysfunkcję stawów, obniżoną jakość życia i liczne powikłania, nakładając istotne obciążenie socjoekonomicze na systemy opieki zdrowotnej.
Pomimo wysokiej częstości występowania, obecne terapie OA pozostają głównie paliatywne, koncentrując się przede wszystkim na łagodzeniu objawów. Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), stanowiące pierwszą linię interwencji farmakologicznych, są powszechnie stosowane do łagodzenia bólu i stanu zapalnego. Jednakże wykazują one toksyczność systemową, krótki okres półtrwania i słabą retencję w stawie. Dostawowe iniekcje hydrożeli, w tym kwasu hialuronowego (HA), oferują lokalne leczenie poprzez zwiększenie lepkosprężystości płynu maziowego, zapewniając tymczasową ulgę w objawach i poprawę funkcjonalną. Niemniej jednak, hydrożele te nie posiadają wewnętrznych właściwości przeciwzapalnych, co ogranicza ich skuteczność kliniczną. Ze względu na przewlekły charakter OA, wymagane jest częste podawanie NLPZ lub hydrożelu HA, co zwiększa ryzyko powikłań żołądkowo-jelitowych, nerkowych i sercowo-naczyniowych.
W odpowiedzi na ograniczenia obecnych terapii OA, badacze zaproponowali innowacyjne podejście terapeutyczne, które integruje przeciwzapalne korzyści NLPZ z mechanicznym wsparciem i zaletami przedłużonego uwalniania hydrożeli. Naproksen jest silnym NLPZ, który hamuje aktywność cyklooksygenazy-2 (COX-2), blokując syntezę prostaglandyn z kwasu arachidonowego i poprawiając zapalne mikrośrodowisko stawu. Jego grupa karboksylowa umożliwia kowalencyjne połączenie z hydrożelatorami, nadając właściwości hydrożelacji. Aby zachować skuteczność naproksenu, sprzężony hydrożelator musi być strukturalnie minimalny, aby uniknąć sterycznego utrudnienia jego miejsca wiązania COX-2.
Czy peptydowe rusztowanie może poprawić terapię OA?
Ultrakriótkie peptydy wyłaniają się jako obiecujące bloki budulcowe ze względu na ich modułową konstrukcję, biokompatybilność i właściwości naśladujące macierz zewnątrzkomórkową. Samoorganizują się one w niskocząsteczkowy hydrożel (LMWH) o regulowanych nanostrukturach i wytrzymałości mechanicznej, co czyni je idealnymi do dostawowego podawania. Wcześniejsze doniesienia wykazały, że sprzęganie naproksenu z samoskładającymi się peptydami nie wpływało negatywnie na jego hamowanie COX-2 in vitro. Co istotne, sprzęganie naproksenu z żelatorami peptydowymi opartymi na D-aminokwasach (np. D-phe-D-phe-x, gdzie x oznaczał brak, D-lys lub D-tyr) zwiększało selektywność COX-2 i stabilność. Strukturalne podobieństwo naproksenu do naftalenu, powszechnej grupy kappującej peptydy, pozwala na wewnętrzną hydrożelację naproksen-peptydu. Na przykład, samoorganizują się one, tworząc stabilne LMWH. Pomimo obiecujących danych in vitro, skuteczność przeciwzapalna in vivo systemów naproksen-hydrożel była rzadko badana, a ich zintegrowane korzyści dla terapii OA pozostają niedostatecznie zbadane.
W omawianym badaniu naukowcy przeprowadzili kompleksową ocenę in vitro i in vivo różnych koniugatów naproksen-peptyd, koncentrując się na ich zachowaniu podczas samoorganizacji, właściwościach mechanicznych, aktywności hamującej COX-2, efektach przeciwzapalnych i skuteczności terapeutycznej w modelach OA. Spośród testowanych koniugatów, naproksen-Phe-Phe-Lys (NpxFFK) samoorganizował się w stabilny LMWH. Ta formulacja wykazała znacznie zwiększoną retencję w stawie po iniekcji dostawowej, minimalizując ekspozycję systemową i zmniejszając częstotliwość podawania, jednocześnie utrzymując trwałe środowisko przeciwzapalne w jamie stawowej.
Hydrożel NpxFFK wykazał wyjątkową biokompatybilność, silne działanie przeciwzapalne i właściwości chroniące chrząstkę zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo. W modelach OA u szczurów, podanie dostawowe skutecznie łagodziło degradację chrząstki stawowej poprzez hamowanie kluczowych czynników zapalnych i przeprogramowanie polaryzacji makrofagów.
Naproksen, jako przedstawiciel NLPZ, napotyka znaczące ograniczenia kliniczne, w tym poważne skutki uboczne i szybkie usuwanie z jamy stawowej. Peptyd difenyloalaniny (FF), dobrze ugruntowany minimalny motyw samoskładający się, może tworzyć hydrożele jako nośniki leków. Połączenie FF z naproksenem stanowi doskonałą strategię przezwyciężenia słabości naproksenu. Wcześniejsze prace B. Xu wykazały, że NpxFF tworzył roztwór wodny przy pH 9,0 z pomocą sonikacji i ogrzewania, który przekształcał się w hydrożel po dostosowaniu pH do 4,0. Ta zależność od kwaśnego pH ogranicza jego użyteczność in vivo. Aby osiągnąć fizjologicznie istotny hydrożel, badacze zaprojektowali naładowane reszty C-końcowe (kwas glutaminowy, histydyna, lizyna lub arginina) na szkielecie NpxFF. Modyfikacja strukturalna (1) zmniejsza hydrofobowość, aby zwiększyć rozpuszczalność w wodzie, (2) umożliwia regulowane samoorganizowanie się przy neutralnym pH i (3) moduluje powinowactwo wiązania COX-2 poprzez zmianę konformacji molekularnej i rozkładu ładunku.
Jak stabilność hydrożelu wpływa na jego działanie?
W konsekwencji, krótkie koniugaty peptydowe NpxFFE, NpxFFH, NpxFFK i NpxFFR zostały przygotowane za pomocą klasycznej syntezy peptydów na fazie stałej (SPPS), z naproksenem (Npx) sprzężonym na N-końcu. Spektrometria masowa wysokiej rozdzielczości i analiza 1H NMR potwierdziły tożsamość molekularną wszystkich koniugatów NpxFFX. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) ujawniła charakterystyczne drgania grupy metoksylowej przy 1263 cm-1 i 1028 cm-1, przypisywane drganiom rozciągającym C-O-C, potwierdzając udaną koniugację naproksenu.
Badacze przeprowadzili dogłębne badania nad samoskładaniem się NpxFFK. Przy stężeniu 20 mg/ml, tylko NpxFFK tworzył stabilny hydrożel, podczas gdy inne koniugaty dawały zawiesiny. Analiza reologiczna wykazała, że NpxFFK wykazywał dominujące zachowanie elastyczne (G’ > G”) w zakresie częstotliwości od 0,1 do 10 Hz, sugerując stabilne tworzenie hydrożelu. W przeciwieństwie do tego, NpxFFE, NpxFFH i NpxFFR wykazywały słabe właściwości mechaniczne, z wartościami G’ spadającymi poniżej wykrywalnego limitu (<0,1 Pa) przy zwiększaniu częstotliwości. HA wykazywał charakterystyczne zachowanie lepkosprężyste. Te ustalenia potwierdziły stabilne tworzenie hydrożelu przez NpxFFK. Co istotne, hydrożel wykazywał zdolność do szybkiej samonaprawy po ustąpieniu naprężenia, co jest niezbędne do zastosowań iniekcyjnych.
Pomiary potencjału zeta ujawniły ładunki powierzchniowe tych peptydów zakończonych naproksenem przy fizjologicznym pH 7,4. Zgodnie z oczekiwaniami, NpxFFE wykazywał bardziej ujemny ładunek (-32 mV) niż naproksen (-20,3 mV), podczas gdy NpxFFH, NpxFFK i NpxFFR wszystkie wykazywały ładunki dodatnie wynoszące odpowiednio 33,8 mV, 19 mV i 29,7 mV. Te makroskopowe różnice są prawdopodobnie przypisane właściwościom ładunkowym peptydów. W warunkach fizjologicznych kwas glutaminowy niesie ładunek ujemny, podczas gdy histydyna, lizyna i arginina niosą ładunki dodatnie. Obrazy TEM ujawniły, że Npx tworzył nierówne agregaty ze względu na stosunkowo niską rozpuszczalność w wodzie. Ujemnie naładowany NpxFFE samoorganizował się w sferyczne cząstki. NpxFFH i NpxFFK tworzyły siatkowe włókniste pasma, przy czym pasma NpxFFK były nieco grubsze niż NpxFFH, a NpxFFR tworzył kłaczkowate zespoły.
Hydrożel NpxFFK wykazał doskonałą biokompatybilność i nie powodował cytotoksyczności u chondrocytów C28/I2 w stężeniach poniżej 1 mM. Gdy stężenie przekraczało 1 mM, żywotność komórek spadała poniżej 80%, przy czym NpxFFH wykazywał znaczną redukcję do zaledwie 20%. Barwienie żywych-martwych komórek potwierdziło minimalną cytotoksyczność przy 400 μM. Badacze dalej ocenili ich wpływ na proliferację chondrocytów, używając barwienia Calcein-AM i kwantyfikacji MTT. Wszystkie grupy komórek pozostały żywotne po 3-dniowej inkubacji. W porównaniu z kontrolą nieleczoną, grupa NpxFFK promowała proliferację chondrocytów, podczas gdy proliferacja zmniejszała się z czasem w grupach NpxFFE, NpxFFH, NpxFFR i Npx. Badania hemolizy potwierdziły minimalną aktywność hemolityczną, potwierdzając dobrą biokompatybilność in vivo.
Czy NpxFFK hamuje stan zapalny na poziomie molekularnym?
Mechanizm działania NpxFFK obejmuje hamowanie COX-2, podobnie jak w przypadku naproksenu. Dokowanie molekularne wykazało, że NpxFFK wiązał się z COX-2 w klasycznej kieszeni aktywnej. Grupa karboksylowa Npx wchodziła w interakcje z resztami Arg-120 i Tyr-355 COX-2, podobnie jak naproksen. Te same reszty były również zaangażowane w interakcje z NpxFFK, sugerując, że NpxFFK hamował COX-2 poprzez mechanizm podobny do Npx. Dodatkowo, fragment Npx w NpxFFK angażował się w interakcje hydrofobowe z resztami Ile-92, Ile-112 i Tyr115 w COX-2. Sprzężona sekwencja peptydowa FFK przyczyniała się do dalszych interakcji wiążących w miejscu aktywnym, w tym wiązań wodorowych, interakcji kation-π i kontaktów hydrofobowych. Obliczona energia swobodnego wiązania dla kompleksu NpxFFK-COX-2 wynosiła -9,06 kcal/mol, wykazując porównywalną zdolność wiązania do kompleksu Npx-COX-2 (-9,36 kcal/mol). Stała inhibicji (Ki) NpxFFK została określona na 227,9 nM, nieco wyższa niż Npx (136,7 nM).
COX-2 jest regulowana w górę podczas stanu zapalnego i katalizuje sekwencyjną konwersję kwasu arachidonowego (AA) do prostaglandyny G2 (PGG2), następnie do PGH2, a ostatecznie do prozapalnej PGE2. Badania wykazały, że NpxFFK wywierał silne działanie przeciwzapalne poprzez hamowanie COX-2, tym samym tłumiąc produkcję PGE2 i ekspresję cytokin zapalnych (IL-1β, IL-1 i IL-6). Aby dalej badać przeciwzapalne efekty NpxFFK na poziomie komórkowym, badacze użyli makrofagów RAW264.7 stymulowanych LPS (1 μg/mL LPS), które wykazały znacznie podwyższoną ekspresję genu COX-2. Leczenie NpxFFK lub Npx obniżało ekspresję COX-2 zarówno na poziomie genu, jak i białka. Co godne uwagi, NpxFFK wykazywał silniejsze i bardziej trwałe hamowanie COX-2 niż Npx, szczególnie przy dłuższym czasie inkubacji (12 godzin dla oceny PCR i 24 godziny dla barwienia immunofluorescencyjnego). Zgodnie z hamowaniem COX-2, oba leczenia zmniejszały produkcję PGE2. Ponadto, leczenie NpxFFK znacząco tłumiło poziomy ekspresji kluczowych czynników zapalnych, takich jak IL-1β, TNF-α i IL-6, z bardziej wyraźnym efektem supresyjnym w porównaniu do leczenia Npx.
Makrofagi wykazują dwa funkcjonalne stany polaryzacji, prozapalny M1 i przeciwzapalny M2, które są kluczowe dla równoważenia odpowiedzi zapalnej i procesów naprawy tkanek. Makrofagi M1 pośredniczą w obronie przed patogenami poprzez wydzielanie cytokin zapalnych, podczas gdy makrofagi M2 promują naprawę tkanek i rozwiązanie stanu zapalnego. Aby ocenić wpływ NpxFFK na polaryzację makrofagów, przeprowadzono analizę immunofluorescencyjną komórek Raw264.7, używając specyficznych markerów powierzchniowych (CD86 jako marker fenotypu M1 i CD163 jako marker fenotypu M2). Leczenie NpxFFK znacząco zwiększało ekspresję CD163 i zmniejszało ekspresję CD86 w porównaniu do stymulacji LPS. Te wyniki sugerowały, że NpxFFK promuje polaryzację makrofagów w kierunku przeciwzapalnego fenotypu M2, jednocześnie tłumiąc prozapalny fenotyp M1, co dodatkowo potwierdza jego silne właściwości przeciwzapalne.
Stres oksydacyjny spowodowany bodźcami zapalnymi zaostrza odpowiedzi zapalne pośredniczone przez makrofagi poprzez inicjację prozapalnych ścieżek, które mogą promować apoptozę chondrocytów, zwiększać aktywność kataboliczną i ostatecznie ustanowić destrukcyjny cykl utrzymującego się stanu zapalnego i degradacji chrząstki. Oceniono zdolność antyoksydacyjną NpxFFK. Sam Npx wykazywał nieistotną aktywność zmiatania rodników. NpxFFK wykazywał umiarkowaną, ale znaczącą aktywność antyoksydacyjną, skutecznie zmiatając zarówno rodniki DPPH, jak i ABTS+ in vitro. Stymulacja LPS na komórkach RAW264.7 powodowała masową produkcję tlenku azotu (NO) ze względu na regulację w górę indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) w stanie zapalnym, a także podwyższone poziomy wewnątrzkomórkowych ROS. Co godne uwagi, leczenie NpxFFK znacząco zmniejszało zarówno produkcję NO, jak i poziom wewnątrzkomórkowych ROS, z większą skutecznością niż wolny Npx.
Czy hydrożel chroni chrząstkę i wydłuża retencję leku?
Aby ocenić potencjał chondroprotekcyjny NpxFFK, badacze ustanowili model zapalenia in vitro, traktując chondrocyty C28/I2 mediami warunkowymi zebranymi z komórek Raw264.7 stymulowanych LPS. Stres zapalny zmniejszał potencjały błony mitochondrialnej chondrocytów. Ponadto, przyspieszał wydzielanie enzymów katabolicznych, takich jak metaloproteinaza macierzy-13 (MMP-13), następnie degradując macierz chrząstki, taką jak kolagen typu II (COL2). Leczenie NpxFFK znacząco przywracało potencjały błony mitochondrialnej komórek C28/I2, obniżało ekspresję genu MMP13 i zwiększało ekspresję genu COL2. Te wyniki sugerowały, że NpxFFK skutecznie chroni chondrocyty przed uszkodzeniem mitochondriów wywołanym stanem zapalnym i degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej pośredniczoną przez MMP, wykazując potencjalną skuteczność terapeutyczną w naprawie chrząstki.
Przed oceną skuteczności terapeutycznej w leczeniu OA, badacze ocenili retencję leku w jamie stawowej. Hydrożel NpxFFK wykazał powolną degradację w PBS, z około 50% pozostałością po 14 dniach. Aby śledzić retencję in vivo, osadzono barwnik emitujący w bliskiej podczerwieni IR783 w hydrożelu NpxFFK lub zmieszano go z roztworem Npx w soli fizjologicznej do iniekcji dostawowej, monitorując sygnały fluorescencyjne w czasie. Dla porównania klinicznego, testowano również kwas hialuronowy (HA), standardową terapię OA. Grupa roztworu IR783/Npx wykazała całkowite zniknięcie fluorescencji do 3 dnia, bez wykrywalnego sygnału pozostającego w stawie kolanowym. IR783 osadzony w HA wykazywał znaczne zmniejszenie sygnału do 7 dnia, podczas gdy IR783 w hydrożelu NpxFFK utrzymywał wykrywalną fluorescencję w jamie stawowej do 14 dni. Te wyniki demonstrują doskonałą zdolność do przedłużonej retencji hydrożelu NpxFFK, zapewniając przedłużoną obecność potrzebną do ciągłego działania przeciwzapalnego leku.
Czy iniekcyjny hydrożel łagodzi ból i naprawia strukturę stawów?
Biorąc pod uwagę wykazane właściwości antyoksydacyjne, przeciwzapalne i chondroprotekcyjne hydrożelu NpxFFK in vitro, badacze przystąpili do oceny jego potencjału terapeutycznego w modelu zapalenia stawów u szczurów. Wywołano zapalenie stawów poprzez iniekcję dostawową jodooctanu sodu (MIA), dobrze ustanowioną metodę cenioną za jej prostotę i szybki rozwój modelu. Udaną indukcję zapalenia stawów potwierdzono siedem dni po iniekcji MIA. Zwierzęta zostały następnie losowo podzielone na cztery grupy leczenia: sól fizjologiczną (kontrola), hydrożel NpxFFK, wolny Npx i HA. Wszystkie leczenia były podawane poprzez iniekcję dostawową co dwa tygodnie przez 28 dni, aby systematycznie ocenić skuteczność terapeutyczną.
Aby ocenić wpływ Npx i hydrożelu NpxFFK na ból związany z zapaleniem stawów, zastosowano analizę odcisków stóp, używając niebieskiego i czerwonego tuszu do rozróżnienia odcisków przednich łap (niebieskie) i tylnych łap (czerwone). Długości kroków i obszary druku zostały zmierzone do analizy ilościowej. Grupa pozorna wykazała podstawową długość kroku wynoszącą 12,83 cm, podczas gdy grupa modelu OA leczona solą fizjologiczną wykazała znaczne skrócenie do 7,57 cm. Leczenia Npx i HA dawały pośrednie poprawy (odpowiednio 9,42 cm i 10,15 cm). Co godne uwagi, grupa hydrożelu NpxFFK osiągnęła długość kroku 13,20 cm statystycznie porównywalną z kontrolami pozornymi, wskazując na znaczną poprawę upośledzenia chodu wywołanego bólem. Jednocześnie oceniono obszar kontaktu tylnej łapy, wrażliwy wskaźnik bólu artretycznego (zmniejszony kontakt odzwierciedla zachowanie na palcach). Grupa leczona solą fizjologiczną wykazała wyraźne zmniejszenie obszaru kontaktu w porównaniu z kontrolami pozornymi. Podczas gdy Npx i HA zapewniały częściową poprawę, hydrożel NpxFFK całkowicie przywracał obszar kontaktu do poziomów pozornych. Te wyniki wykazały, że hydrożel NpxFFK przewyższa zarówno Npx, jak i HA w przywracaniu normalnej długości kroku i obszaru kontaktu łapy. Ta lepsza wydajność prawdopodobnie wynika z jego właściwości przedłużonego uwalniania leku, utrzymując skuteczne stężenia przeciwzapalne i przeciwbólowe w miejscu urazu.
Po zakończeniu początkowego 14-dniowego okresu leczenia, badacze podali drugą dawkę soli fizjologicznej, hydrożelu NpxFFK, wolnego Npx lub hydrożelu HA na dodatkowe 14 dni. Po tym przedłużonym leczeniu, szczury zostały uśmiercone, a stawy kolanowe zebrane do kompleksowej oceny anatomicznej, histologicznej i sekwencjonowania RNA. Makroskopowa ocena próbek kości udowej ujawniła ciężkie zniszczenie chrząstki w kontrolach leczonych solą fizjologiczną, z rozległą erozją warstwy chrząstki kości udowej i widoczną ekspozycją podchrzęstnej kości w zlokalizowanych obszarach ubytków – cechami charakterystycznymi zaawansowanej patologii OA. Zarówno leczenie hydrożelem NpxFFK, jak i HA wykazało wyraźne zmniejszenie ciężkości uszkodzenia chrząstki w porównaniu z kontrolami z solą fizjologiczną. Obrazy MRI ujawniły, że szczury po leczeniu hydrożelem NpxFFK lub HA utrzymały kompletną architekturę chrząstki kolanowej porównywalną z kontrolami pozornymi. Jednakże, analiza mikro-CT ujawniła ważne różnice: podczas gdy leczenie HA wykazywało resztkową erozję chrząstki i uszkodzenie jamy stawowej, hydrożel NpxFFK skutecznie zapobiegał zniszczeniu kości i tworzeniu osteofitów. Mikrostruktury podchrzęstnej kości beleczkowej zostały dalej ocenione poprzez pomiar gęstości mineralnej kości (BMD), frakcji objętości kości (BV/TV), separacji beleczkowej (Tb.SP) i liczby beleczek (Tb.N). Te pomiary potwierdziły, że leczenie NpxFFK znacząco poprawiło wszystkie metryki jakości kości w porównaniu z innymi grupami leczenia. Zbiorowo, ustalenia badaczy wykazują, że hydrożel NpxFFK daje lepsze wyniki terapeutyczne w tym modelu OA, przewyższając zarówno wolne leczenie Npx, jak i HA we wszystkich modalnościach oceny.
Czy molekularna analiza potwierdza skuteczność terapii?
Analiza histologiczna przy użyciu barwienia hematoksyliną i eozyną oraz barwienia Safranin O-Fast green potwierdziła te ustalenia. Grupa kontrolna leczona solą fizjologiczną wykazała charakterystyczną patologię OA, pokazując znaczną erozję chrząstki, rozpad macierzy zewnątrzkomórkowej i zaburzoną organizację chondrocytów. W uderzającym kontraście, grupa leczona NpxFFK utrzymywała dobrze zachowaną architekturę chrząstki z gładkimi powierzchniami stawowymi i minimalnymi oznakami uszkodzenia chondrocytów, wykazując wyjątkową ochronę chrząstki. Co godne uwagi, chrząstka stawowa w grupie NpxFFK ma lepszą strukturę i gładszą powierzchnię niż w grupie iniekcji Npx i HA. Wzory barwienia Safranin O-Fast green wykazały szczególnie jednolity rozkład proteoglikanów w całej macierzy chrząstki stawów leczonych NpxFFK, wskazując na aktywne procesy naprawy tkanek. Ilościowa ocena przy użyciu zmodyfikowanego systemu punktacji Mankina obiektywnie wykazała lepszą skuteczność grupy NpxFFK w łagodzeniu progresji OA w porównaniu z leczeniem wolnym Npx. Ponadto, pomiary przestrzeni stawowej potwierdziły, że leczenie hydrożelem NpxFFK skutecznie zapobiegało patologicznemu zwężeniu przestrzeni stawowej, przewyższając zarówno podejścia terapeutyczne Npx, jak i HA.
COX-2 jest regulowana w górę w OA i szybko reaguje na bodźce prozapalne, z cytokinami takimi jak TNF-α i IL-1β napędzającymi następujący rozpad chrząstki. Analizy immunofluorescencyjne i immunohistochemiczne ujawniły istotnie podwyższone poziomy COX-2, TNF-α, IL-1β w kontrolach OA leczonych solą fizjologiczną, potwierdzając charakterystyczną patologię zapalną. Leczenie hydrożelem NpxFFK całkowicie tłumiło poziom COX-2. Leczenie NpxFFK, Npx i HA znacząco zmniejszało ekspresję COX-2 i prozapalnych cytokin TNF-α i IL-1β, z NpxFFK pokazującym najbardziej wyraźną supresję. Ten przeciwzapalny efekt in vivo był dalej wspierany przez analizę polaryzacji makrofagów, gdzie leczenie NpxFFK znacząco zmniejszało prozapalny fenotyp M1, jednocześnie promując przeciwzapalny fenotyp M2, potwierdzając jego przeciwzapalne efekty. Kolagen typu II (COL2), fundamentalny składnik strukturalny macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki, jest niezbędny do utrzymania integralności tkanek. Immunohistochemia pokazała ciężkie wyczerpanie COL2 w stawach OA leczonych solą fizjologiczną, wskazując na upośledzenie syntezy ECM. W przeciwieństwie do tego, leczenie NpxFFK wyraźnie przywracało ekspresję COL2, demonstrując zwiększoną zdolność naprawy chrząstki. Ponadto, hydrożel NpxFFK znacząco tłumił ekspresję MMP13 w tkankach stawowych w porównaniu z kontrolami z solą fizjologiczną, chroniąc przed degradacją macierzy. Testy krwi ujawniły, że po leczeniu hydrożelem NpxFFK, parametry hematologiczne szczurów pozostały w normalnych zakresach. Barwienie H&E głównych narządów, w tym serc, wątroby, śledziony, płuc, nerek i żołądków, nie wykazało oznak przewlekłego stanu zapalnego lub uszkodzenia tkanek. Te ustalenia zbiorowo ustanowiły hydrożel NpxFFK jako zarówno wysoce skuteczny, jak i biokompatybilny dla długoterminowego leczenia OA.
Aby wyjaśnić mechanizm terapeutyczny hydrożelu NpxFFK w leczeniu OA, przeprowadzono analizę sekwencjonowania RNA chrząstek stawu kolanowego z grup leczonej solą fizjologiczną i NpxFFK. Analiza porównawcza zidentyfikowała 429 różnicowo ekspresjonowanych genów (DEG) (p < 0,05, log2(FoldChange) > 2), składających się z 215 obniżonych i 214 podwyższonych genów w grupach NpxFFK w porównaniu z kontrolą z solą fizjologiczną. Najbardziej istotnie obniżone DEG obejmowały geny związane z odpowiedzią immunologiczną (Mzb1, Ighm, Ighg), geny związane z odpowiedzią na utleniacze (syntaza tlenku azotu 2 Nos2 i laktoperoksydaza Lpo), mediator różnicowania osteoklastów (Oscar) i Igfbp2, który osłabia sygnalizację insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF) w patogenezie OA. Tymczasem, najbardziej istotnie podwyższone DEG obejmowały składniki sygnalizacji transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) (Nrep i Mstn), regulator immunologiczny (RT1-CE16), mediator naprawy kości (Itm2a), zaangażowany w regulator metaboliczny (Fbp2), regulujący i regulatory proliferacji/różnicowania komórek (Myf6, Fgfr4 i Trim3).
Analiza wzbogacenia ontologii genów (GO) ujawniła, że leczenie hydrożelem NpxFFK znacząco obniżyło odpowiedzi zapalne (odpowiedź obronna, odpowiedź immunologiczna, przewlekła odpowiedź zapalna, produkcja interleukin) i odpowiedzi oksydacyjne (biosynteza NO, odpowiedź na wodoronadtlenek lipidowy i produkcja anionu ponadtlenkowego (O2•-)). W przeciwieństwie do tego, geny o podwyższonej ekspresji były głównie związane z procesami metabolicznymi i naprawczymi, takimi jak metabolizm glukozy, metabolizm ATP i metabolizm DNA, kostnienie, wzrost komórek i biosynteza węglowodanów. Analiza ścieżki KEGG wykazała, że DEG były wzbogacone w ścieżki związane z regulacją odpowiedzi zapalnej (ścieżka sygnalizacyjna receptora podobnego do NOD, ścieżka sygnalizacyjna IL-17, interakcja receptor-cytokina), odpowiedzią oksydacyjną (biosynteza argininy), ścieżkami wzrostu i różnicowania komórek (ścieżka sygnalizacyjna TGF-β i ścieżki regulujące pluripotencję komórek macierzystych), a także ścieżką związaną z bólem (interakcja ligand-receptor neuroaktywny). Analiza wzbogacenia zestawu genów (GESA) dalej wskazywała, że leczenie hydrożelem NpxFFK zmniejszało odpowiedź zapalną na bodziec antygenowy, jednocześnie przywracając funkcje mitochondrialne poprzez wzmocnienie kompleksów zawierających białka mitochondrialne, szczególnie kompleksu białkowego wewnętrznej błony mitochondrialnej i aktywności dehydrogenazy NADH. Te zmiany zbiorowo aktywowały krytyczną ścieżkę produkcji energii, w tym glikolizę, fosforylację oksydacyjną i cykl cytrynianu (cykl TCA), prowadząc do zwiększonej syntezy ATP. Wynikające z tego poprawy metaboliczne ułatwiały proliferację i różnicowanie chondrocytów. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez regulowaną w górę ekspresję genów kolagenu. Biorąc wszystko razem, te ustalenia ustanowiły, że hydrożel NpxFFK wywiera swoje efekty terapeutyczne poprzez wieloaspektowy mechanizm: zmniejszanie stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego, jednocześnie zwiększając metabolizm komórkowy i dostawę energii, aby wspierać naprawę i regenerację chrząstki.
Podsumowanie
Artykuł przedstawia nowatorskie podejście do leczenia osteoartretyzmu (OA) z wykorzystaniem innowacyjnego hydrożelu NpxFFK, łączącego właściwości przeciwzapalne naproksenu z zaletami samoorganizującego się peptydu. Badania wykazały, że hydrożel NpxFFK charakteryzuje się doskonałą biokompatybilnością, stabilnością mechaniczną i przedłużoną retencją w stawie. Wykazuje silniejsze działanie przeciwzapalne niż sam naproksen, skutecznie hamując COX-2 i zmniejszając poziom cytokin prozapalnych. W modelach zwierzęcych znacząco łagodził ból, chronił chrząstkę przed degradacją i promował jej regenerację. Molekularna analiza potwierdziła, że NpxFFK działa poprzez złożony mechanizm obejmujący redukcję stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego oraz poprawę metabolizmu komórkowego. To innowacyjne rozwiązanie przewyższa skutecznością obecnie stosowane terapie OA, oferując potencjalnie przełomową metodę leczenia tej choroby.
