Hydrożele polisacharydowe w leczeniu ran – nowe możliwości terapeutyczne

Czy hydrożele z polisacharydami rewolucjonizują opiekę nad ranami?

Przewlekłe rany stanowią jeden z najważniejszych problemów zdrowotnych i są niewątpliwie istotną przyczyną zgonów na całym świecie. Wykorzystanie odpowiednich opatrunków jest niezbędne do wspomagania procesu gojenia ran. Wśród nich bardzo popularne są produkty na bazie hydrożeli, które dzięki swoim właściwościom mogą znacząco skrócić czas gojenia i zmniejszyć ryzyko nawracających infekcji. Poszukuje się różnych dodatków do składu hydrożeli, które mogą przyspieszyć regenerację ran i zminimalizować uczucie bólu. Naturalne związki polisacharydowe, w tym chitozan (Ch) i kwas hialuronowy (HA), są często stosowane w zastosowaniach medycznych i farmaceutycznych jako materiały wyjściowe do hydrożeli. Chitozan i kwas hialuronowy są podstawowymi składnikami do tworzenia materiałów naśladujących macierz zewnątrzkomórkową. Ich zastosowanie jest korzystne ze względu na biokompatybilność, brak toksyczności, niską tendencję do wywoływania alergii i stosunkowo niską cenę.

Chitozan wykazuje naturalne działanie przeciwzapalne, przeciwgrzybicze i przeciwbakteryjne. Zmniejsza również uczucie bólu. Ze względu na dobrą biokompatybilność i biodegradowalność, matryce opatrunkowe na bazie chitozanu przewyższają inne materiały w promowaniu gojenia ran. W szczególności, Ch może poprawiać proliferację i granulację fibroblastów, stymulować neutrofile, wpływać na płynność błon, wzmacniać działanie przeciwbólowe i hemostatyczne, promować aktywację makrofagów i tworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ponadto, chitozan ma zdolność zatrzymywania wody, co ma ogromne znaczenie podczas procesu naprawy i regeneracji tkanek skóry. Jednocześnie zdolność do absorpcji nadmiaru wysięku zapalnego pozwala utrzymać otoczenie rany w czystości.

Przy kwaśnym pH, dodatnio naładowane grupy obecne w strukturze chitozanu czynią go kationowym polielektrolitem (pKa 6,1-6,5). Kationowy charakter Ch sprzyja interakcjom z szeroką gamą anionowych glikozaminoglikanów (GAG). Jednym z nich jest kwas hialuronowy (HA) o strukturze podobnej do chitozanu. HA jako naturalny składnik skóry aktywnie uczestniczy w wielu procesach regulacyjnych, takich jak proliferacja, migracja i różnicowanie komórek. Jako wysoce hydrofilowy biopolimer, jest w stanie absorbować duże ilości wody i tworzyć luźno uwodnioną sieć, która kontroluje nawilżenie tkanek i transport wody w macierzy zewnątrzkomórkowej. HA jest polianionowym biopolimerem (pKa 3,0), który po zmieszaniu z przeciwnie naładowanym polikationowym chitozanem tworzy kompleksy polielektrolitowe (PEC) poprzez kooperatywne oddziaływania elektrostatyczne. Jednakże zaangażowane są również siły międzycząsteczkowe, w tym wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe i dipolowe. W tych kompleksach wewnętrzne właściwości poszczególnych związków są zachowane, ale wraz z połączeniem uzyskuje się dodatkowe korzyści. Hydrożele Ch-HA umożliwiają hodowlę komórek produkujących macierz skóry (keratynocytów) i są skuteczne w przyspieszaniu gojenia ran po ablacji skóry bez powodowania efektów ubocznych, takich jak reakcje zapalne i toksyczność.

Jak naproksen oraz polisacharydy modulują strukturę modeli błonowych?

W tym artykule lekiem zainteresowania jest naproksen (NAP), który jest jednym z niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ). Naproksen jest lekiem pierwszego wyboru w leczeniu bólu łagodnego do umiarkowanego i gorączki, urazów tkanek miękkich i zaburzeń zapalnych. Jest szeroko stosowany do kontrolowania stanu zapalnego. Krótkotrwałe stosowanie tego leku przyspiesza gojenie ran poprzez zmianę poziomów cytokin zapalnych. Działanie przeciwzapalne naproksenu było wielokrotnie potwierdzane w ostatnich dziesięcioleciach i szczegółowo przedstawiane w wielu pracach. NLPZ są inhibitorami proenzymu zapalnego cyklooksygenazy (COX). Ten enzym związany z błoną komórkową uczestniczy w przekształcaniu kwasu arachidonowego w prostaglandyny, hormony pośredniczące w rozwoju reakcji zapalnych, które mają działanie ochronne przed uszkodzeniami błony śluzowej żołądka. Działanie przeciwzapalne NLPZ wynika z obniżenia progu pobudliwości receptorów bólu. Jednym z głównych wyzwań związanych z stosowaniem NLPZ jest ich słaba tolerancja żołądkowo-jelitowa i szereg działań niepożądanych związanych z nieprawidłowym funkcjonowaniem żołądka. Żołądkowe efekty doustnie podawanego naproksenu mogą być w pewnym stopniu złagodzone przez jego bezpośrednie uwalnianie z hydrożelu polisacharydowego w miejscu docelowym.

Polisacharydy są skutecznie wykorzystywane jako nośniki NAP poprzez tworzenie proleku i oferują mechanizm poprawy skuteczności i dostarczania leku. Mają unikalne zalety, takie jak właściwości mukoadhezyjne i zdolność magazynowania wody, które wspomagają ładowanie NAP przez błonę komórkową. Chitozan tworzy barierę żelową w kwaśnym środowisku, służąc jako substancja pomocnicza i modulująca w systemach uwalniania leków. Przeciwbakteryjny charakter chitozanu jest szczególnie korzystny. Kwas hialuronowy z kolei jest szczególnie ważny w preparatach z naproksenem nakładanych bezpośrednio na skórę. Jako naturalna substancja hydrofilowa, zapewnia odpowiednie nawilżenie rany i/lub absorpcję wysięku. Dobrym rozwiązaniem mogłoby być włączenie NAP do składu opatrunku hydrożelowego i uwalnianie leku bezpośrednio w miejscu rany. Daje to możliwość znacznego skrócenia czasu potrzebnego substancji leczniczej na przenikanie przez błony biologiczne, gdzie rozpoczyna się szlak COX, a tym samym osiągnięcie lepszej kontroli nad bólem i gojeniem ran.

NAP ma zdolność zmiany interakcji w warstwie hydrolipidowej błon komórkowych. Oddziałuje albo z apolarnymi łańcuchami węglowodorowymi, albo z polarnymi grupami głowymi lipidów, wpływając na hydratację grup głowowych. Dlatego ważne jest prowadzenie badań, które będą źródłem kluczowych informacji na temat specyficznych interakcji leków ze składnikami lipidowymi błon komórkowych w obecności polisacharydów. Monowarstwy Langmuira są szeroko stosowane jako model naturalnych błon do badania takich interakcji między lipidami, szczególnie fosfolipidami, a różnymi cząsteczkami zainteresowania, takimi jak leki. Fosfolipidy, jako główne składniki błony, są odpowiedzialne za kilka jej właściwości, takich jak stabilność i półprzepuszczalność. Błony komórkowe eukariontów są głównie złożone z fosfatydylocholin.

Celem tego artykułu jest scharakteryzowanie właściwości fizykochemicznych monowarstw 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny (DPPC) z dodatkiem naproksenu (NAP) na subfazie polisacharydowej (Ch i/lub HA). Ponieważ oba polisacharydy mają komplementarne grupy funkcyjne (aminowe, karboksylowe), użycie mieszaniny Ch-HA umożliwia tworzenie sieci jonowej, co jest korzystne w produkcji hydrożeli wielosieciowych z potencjałem jako ulepszona matryca do gojenia ran. Same polisacharydy nie tworzą monowarstw Langmuira, ale będąc składnikami fazy wodnej w bezpośrednim kontakcie z błoną, zapewniają imitację zachowania interfejsu komórka/hydrożel.

Aby osiągnąć cel, zastosowano technikę monowarstwy Langmuira w połączeniu z mikroskopią kąta Brewstera (BAM). Zarejestrowano izotermy kompresji/adsorpcji i obrazy morfologii w temperaturze 20°C. Pozwoliły one określić wpływ zastosowanej subfazy na elastyczność (upakowanie i uporządkowanie) monowarstw DPPC, ich morfologię i stabilność w funkcji czasu. Aktywność przeciwzapalna naproksenu nie była badana bezpośrednio. Nasze badania koncentrowały się jednak głównie na etapie dostarczania leku do miejsca bólu w celu uniknięcia skutków ubocznych. Stąd szczegółowo omówiliśmy wpływ naproksenu bezpośrednio na modelowe błony komórkowe. Zidentyfikowano potencjalny sposób interakcji między fosfolipidem, lekiem i polisacharydami, odpowiedzialny za zmianę właściwości fizykochemicznych błon. Te interakcje regulują skuteczność systemów dostarczania leków, w tym kontrolowane uwalnianie cząsteczek leku, co może być kluczowe dla lepszego zrozumienia różnych mechanizmów biofizycznych na poziomie molekularnym.

Czy monowarstwa DPPC zachowują stabilność w dynamicznych warunkach?

Izotermia π−A dla W/DPPC (monowarstwy DPPC na wodzie) wykazuje typowy profil z charakterystycznym plateau odzwierciedlającym przejście fazowe pierwszego rzędu z fazy ciekłej rozszerzonej do ciekłej skondensowanej (LE/LC) przy π = 6,2 mN/m i infleksję przy wysokim ciśnieniu powierzchniowym 72 mN/m z powodu utraty struktury dwuwymiarowej. Położenie izoterm kompresji zmienia się zauważalnie wraz z dodawaniem poszczególnych składników do subfazy wodnej. Objawia się to różnicami w obszarze początkowym (A0), obszarze granicznym (Alim), ciśnieniu przejścia fazowego LE/LC (πpt) i ciśnieniu kolapsu (πc).

Biorąc pod uwagę monowarstwy DPPC bez naproksenu na różnych subfazach, można zauważyć, że obecność HA w subfazie zmniejsza obszar początkowy, przesuwając tym samym izotermy w kierunku mniejszych obszarów molekularnych (w lewo). Przeciwnie, chitozan rozszerza monowarstwy DPPC, powodując zwiększenie obszaru początkowego i tym samym umieszczając izotermy w regionie większych obszarów molekularnych (w prawo). Podobne obserwacje odnotowano wcześniej. Wskazuje to na wstawienie cząsteczek chitozanu między cząsteczki DPPC, z jednoczesnym osłabieniem sił przyciągających DPPC-DPPC. Co ciekawe, efekt rozszerzenia jest wzmocniony dla mieszaniny Ch-HA. Wynika to ze zdolności tych dwóch polisacharydów do tworzenia kompleksów w wodzie, przy czym kwas hialuronowy ma decydujący wpływ ze względu na swoje silne właściwości hydrofilowe.

W roztworze wodnym HA tworzy luźno uwodnioną sieć. Chitozan przenika tę strukturę, tworząc kompleksy poprzez siły międzycząsteczkowe, a także interakcje hydrofobowe i elektrostatyczne. Ta elastyczna struktura pozwala na synergię właściwości fizykochemicznych w porównaniu z charakterystyką poszczególnych składników, co zostanie wykazane w toku dalszych rozważań.

Podobny trend zmian dla Ch, HA i Ch-HA obserwuje się dla Alim określonego dla ściśle upakowanych monowarstw DPPC na tych subfazach przy wysokich wartościach ciśnienia powierzchniowego. Oznacza to, że polisacharydy są stabilnie wbudowane w strukturę monowarstwy DPPC i nie są wypychane z niej nawet w stanie wysokiej kompresji. Tylko dla Ch/DPPC i HA-Ch/DPPC izotermy zbiegają się przy ciśnieniach powierzchniowych powyżej 20 mN/m, wskazując na dominujący wpływ Ch nad HA na właściwości monowarstwy DPPC. Ciśnienia kolapsu (πc) wszystkich monowarstw są podobne i nie różnią się o więcej niż 2,7 mN/m. Co ważne, składniki subfazy nie powodują zaniku przejścia fazowego LE/LC, ale tylko nieznacznie wpływają na wartość ciśnienia powierzchniowego (πpt), przy którym ono występuje. Najwyższą wartość πpt uzyskuje się dla Ch-HA/DPPC (9,5 mN/m), co wskazuje, że mieszane polisacharydy najbardziej utrudniają tworzenie domen fazy skondensowanej DPPC w porównaniu do poszczególnych składników.

Sam naproksen nie tworzy typowych monowarstw Langmuira na granicy ciecz-gaz. Jednak jego obecność w regionie międzyfazowym otoczonym przez cząsteczki DPPC tworzące film pozwala na badanie interakcji DPPC-NAP za pomocą techniki monowarstwy Langmuira. Dodanie naproksenu wpływa na właściwości monowarstwy DPPC w zależności od składu subfazy. W warunkach eksperymentalnych naproksen występuje praktycznie w formie niezdysocjowanej (pKa 4,57); dlatego ma powinowactwo do ogonów węglowodorowych fosfolipidów. W początkowym etapie kompresji cząsteczki NAP są zlokalizowane między cząsteczkami DPPC. Powoduje to zwiększenie obszaru przypadającego na cząsteczkę DPPC, co ujawniają wyższe wartości parametru A0. Tylko dla subfazy wodnej A0 jest niższe. Podczas dalszej kompresji cząsteczki NAP migrują w kierunku regionu hydrofobowego monowarstw DPPC i pozostają tam nawet przy wysokich wartościach ciśnienia powierzchniowego. Dlatego obserwuje się przesunięcie izoterm π−A w kierunku większych obszarów molekularnych dla DPPC-NAP na wszystkich subfazach. Zwiększenie obszaru jest również wyraźnie widoczne w ściśle upakowanych monowarstwach, o czym świadczą wartości Alim.

Najmniejszy efekt obserwuje się na czystej wodzie (Alim zwiększa się o 1,7 Å2), ale dodanie polisacharydów intensyfikuje go: Ch o 2,5 Å2, HA o 5,1 Å2 i Ch-HA o 3,4 Å2 w porównaniu do monowarstw bez NAP. W tym przypadku nie mamy do czynienia z efektem synergicznym dla mieszaniny Ch-HA, ale tylko z efektem średnim.

Ciśnienie kolapsu (πc) jest znacznie zmniejszone o średnio 13 mN/m, co pośrednio wskazuje na niższą stabilność monowarstw DPPC-NAP. Tymczasem πpt wzrasta o wartość w zakresie 0,5-2,9 mN/m, co wyraźnie dowodzi, że naproksen utrudnia pionizację cząsteczek DPPC w celu utworzenia domen fazy skondensowanej.

Aby scharakteryzować stan fizyczny monowarstw DPPC na różnych subfazach i możliwe przejścia fazowe, obliczono moduł kompresji (CS−1) poprzez różniczkowanie izoterm π−A. Moduł kompresji jest parametrem opisującym elastyczność monowarstw (stopień upakowania i uporządkowania). Im wyższa wartość CS−1, tym niższa elastyczność i tym większe upakowanie i uporządkowanie molekularne.

Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, elastyczność monowarstwy DPPC na subfazie wodnej jest opisana przez dwa maksima CS−1 oddzielone minimum. To minimum odpowiada plateau na izotermie π−A i jest związane z przejściem fazowym LE/LC, podczas gdy maksymalna wartość około 250 mN/m dowodzi fazy skondensowanej (LC) monowarstwy. Dane dla modułu kompresji regionu fazy LC (CS−1 powyżej 100 mN/m) pokazują niewielki wzrost elastyczności monowarstw DPPC na wszystkich subfazach polisacharydowych, który jest dodatkowo wzmocniony przez obecność naproksenu. Największą redukcję modułu kompresji (CS, max2−1) dla monowarstwy DPPC obserwuje się w obecności NAP na mieszanej subfazie Ch-HA (o 65 mN/m). Biorąc pod uwagę ten parametr, możemy ponownie mówić o efekcie synergii przy jednoczesnym stosowaniu dwóch polisacharydów. Tymczasem indywidualne polisacharydy zmniejszają CS−1 w mniejszym stopniu – o 11 mN/m i 31 mN/m odpowiednio dla Ch i HA.

Biorąc pod uwagę elastyczność przy 30 mN/m, zmiany wywołane przez poszczególne polisacharydy są bardzo podobne do tych uzyskanych przy CS, max2−1, podczas gdy spadek CS−1 dla mieszaniny Ch-HA jest mniejszy, wynoszący 17 mN/m. Oznacza to, że elastyczność Ch-HA/DPPC-NAP drastycznie wzrasta przy ciśnieniach powierzchniowych powyżej odpowiadającego ciśnienia wewnętrznego naturalnych błon. Następuje wtedy większe zakłócenie upakowania molekularnego DPPC przez oba polisacharydy i NAP. Spadek CS−1 spowodowany przez NAP jest podobny do wcześniej zgłoszonego przez Przykaza i in. Luźna sieć polisacharydowa umożliwia dyfuzję cząsteczek wody i/lub leku. Jest to ważne dla zastosowań w pielęgnacji ran, gdzie wysoka zawartość wody utrzymuje skórę dobrze nawilżoną, a elastyczność sieci pozwala na precyzyjną modulację uwalniania leku. Uzyskane wyniki po raz kolejny potwierdzają wiodący wpływ elastycznej struktury Ch-HA w tego typu układzie z potencjalnymi zastosowaniami jako system dostarczania leków.

Jakie mechanizmy interakcji wpływają na skuteczność terapii przeciwzapalnej?

W celu określenia stabilności monowarstw DPPC w czasie, zarejestrowano zmiany ciśnienia powierzchniowego podczas 60 minut relaksacji na różnych subfazach. Pomiary relaksacji rozpoczęto po wcześniejszej kompresji monowarstwy do ciśnienia powierzchniowego 30 mN/m i zatrzymaniu barier, które nie kompresowały dłużej. W zależności od składu subfazy, monowarstwy DPPC ujawniają różne odpowiedzi na mechaniczną kompresję. Dla wszystkich monowarstw obserwuje się spadek ciśnienia powierzchniowego w czasie, co jest wskaźnikiem zmniejszonej stabilności z powodu wyrzucania cząsteczek z interfejsu. Wyraźny spadek jest widoczny w ciągu pierwszych 10-15 minut relaksacji, od 1% dla AA/DPPC do 9% dla Ch/DPPC. W miarę postępu eksperymentu tempo spadku zwalnia i ostatecznie zmiany π/π0 są bardzo niewielkie, biegnąc równolegle do osi czasu, wskazując na stabilność monowarstwy. Po godzinie relaksacji najwyższą redukcję π/π0 o 12% uzyskano dla Ch/DPPC, co wskazuje na najniższą stabilność monowarstwy DPPC na subfazie chitozanowej.

Wyniki potwierdzają, że cząsteczki chitozanu wykazują wysokie powinowactwo do cząsteczek DPPC i migrują do i/lub akumulują się pod monowarstwą, prowadząc do jej lokalnej destabilizacji i desorpcji niektórych cząsteczek fosfolipidów z interfejsu ciecz-powietrze do subfazy. Dlatego obszar na cząsteczkę w monowarstwie DPPC zmniejsza się, chociaż pozycja barier jest utrzymywana na stałym poziomie. Koreluje to ze zmniejszonym ciśnieniem powierzchniowym. Tymczasem inny polisacharyd (HA) powoduje spadek π/π0, który jest o połowę mniejszy, osiągając 6% po godzinie. Co ważne, zmiany π/π0 dla mieszaniny Ch-HA są pośrednie między tymi dla Ch i HA, co oznacza, że kombinacja Ch-HA zapewnia lepszą stabilność monowarstwy DPPC niż sam Ch i jest porównywalna z HA/DPPC po 1 h.

Podobne trendy obserwuje się w obecności naproksenu, ale NAP wzmacnia wpływ polisacharydów na stabilność monowarstwy DPPC. Po godzinie relaksacji przy początkowym ciśnieniu powierzchniowym 30 mN/m, spadek π/π0 wynosi 20% dla Ch/DPPC-NAP, 7% dla HA/DPPC i 15% dla Ch-HA. HA zapobiega desorpcji cząsteczek monowarstwy do fazy objętościowej w największym stopniu, podczas gdy Ch wzmacnia ten proces. Ponownie, zastosowanie mieszaniny Ch-HA równoważy ten efekt, wskazując na konkurencyjne interakcje polisacharydów z DPPC. W zależności od subfazy, bardziej destabilizujący wpływ NAP przejawia się w dalszym spadku π/π0 o 8% (Ch/DPPC-NAP), 1% (HA/DPPC-NAP) i 9% (Ch-HA/DPPC-NAP) w porównaniu do odpowiednich systemów bez NAP. Niemniej jednak, jednogodzinna relaksacja prowadzi do praktycznie stałych wartości ciśnienia powierzchniowego, z niewielką utratą materiału z interfejsu, demonstrując w ten sposób zadowalającą stabilność monowarstw na badanych subfazach.

Innym sposobem określenia stabilności monowarstw DPPC na różnych subfazach były zmiany średniego obszaru molekularnego przy stałym ciśnieniu powierzchniowym (30 mN/m) utrzymywanym przez oscylujące ruchy barier ze stałą prędkością w określonym okresie czasu (1 h). Wyniki wyraźnie pokazują tylko 2% redukcję średniego obszaru molekularnego w ciągu jednej godziny równoważenia na subfazach polisacharydowych (Ch/DPPC, HA/DPPC i Ch-HA/DPPC), podczas gdy dla W/DPPC redukcja wynosi 1,5%, a dla AA/DPPC tylko 0,5%. Powyższe dane wskazują na wysoką stabilność badanych układów poddanych stałej sile zewnętrznej. Gęstość upakowania cząsteczek DPPC zmienia się nieznacznie. Można oczekiwać, że tak małe zmiany w upakowaniu molekularnym nie będą miały znaczącego wpływu na funkcje biologiczne błon.

W obecności NAP, zależności A−t są raczej bardziej zróżnicowane, a 3% redukcję obszaru molekularnego uzyskuje się dla Ch-HA/DPPC-NAP, 2% dla Ch/DPPC-NAP i 1,5% dla HA/DPPC-NAP. Dla subfaz wodnych i AA zmiany A/A0 są najmniejsze (0,5%) i podobne do siebie. Dlatego można stwierdzić, że decydującym czynnikiem odpowiedzialnym za niewielką utratę cząsteczek DPPC są ich interakcje z polisacharydami, które wciągają cząsteczki fosfolipidów do subfazy. Dla monowarstw DPPC z naproksenem różnica w średnim obszarze molekularnym wynosi około 1% w porównaniu do tych bez naproksenu. Te badania wyraźnie potwierdzają stabilność testowanych systemów. Dlatego zastosowanie chitozanu w połączeniu z kwasem hialuronowym powszechnie obecnym w matrycy skóry jest racjonalnym podejściem do poprawy gojenia ran. Ich wewnętrzne właściwości mogą chronić ranę, przyspieszać regenerację tkanek i zapobiegać infekcjom bakteryjnym.

Wiadomo, że naproksen, jako niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ), jest niespecyficznym inhibitorem szlaku cyklooksygenazy (COX), hamując tym samym tworzenie mediatorów zapalnych, takich jak prostaglandyny. Transformacja kwasu arachidonowego, która inicjuje szlak zapalny, jest procesem związanym z błoną i powinna zależeć zarówno od właściwości fizykochemicznych błony, jak i zmian wynikających z wiązania leku. Ponieważ COX jest enzymem związanym z błoną, badanie parametrów błony przed i po podaniu naproksenu pośrednio dostarcza informacji o przeciwzapalnym działaniu leku. Te interakcje błona-lek mogą być dalej modyfikowane w obecności polisacharydów, często stosowanych w systemach dostarczania leków i opatrunkach na bazie hydrożeli. Dlatego zrozumienie właściwości fizykochemicznych błon lipidowych jest kluczowe w kontekście zarówno ich funkcji biologicznych, jak i potencjalnych zastosowań.

Cząsteczki DPPC na subfazie wodnej tworzą skondensowaną monowarstwę LC, w której łańcuchy all-trans są nachylone względem normalnej do płaszczyzny subfazy. Nachylenie jest spowodowane kompensacją niedopasowania w wymaganiach przestrzennych między głową a ogonem. Głowy są stosunkowo duże i narzucają obszar zajmowany przez cząsteczkę w fazie LC, który wynosi około 41 Å2 w najbardziej ściśle upakowanym stanie. Ta wartość jest większa niż minimalny przekrój poprzeczny dwóch łańcuchów węglowodorowych PC, który wynosi 38 Å2. Jak ujawnili Ma i Allen, trzy grupy metylowe choliny są nachylone od normalnej powierzchni i ustawione nieco równolegle do interfejsu powietrze-woda. Ponadto grupa fosforanowa jest znacznie mniej uwodniona w fazie LC, ponieważ woda jest wyciskana z powłoki hydratacyjnej grupy głowowej podczas kompresji. Może to sprzyjać tworzeniu wiązań wodorowych z innymi składnikami subfazy, gdy są one obecne na interfejsie. Ten proces może być wspomagany przez fakt, że cząsteczki zwitterjonowe DPPC oddziałują za pośrednictwem sił Lifshitza-van der Waalsa i nie tworzą wiązań wodorowych między sobą.

Rozważmy teraz interakcje między HA i cząsteczkami DPPC. HA posiada powinowactwo do monowarstwy DPPC i jest adsorbowany na jej powierzchni poprzez interakcje hydrofobowe i tworzenie wiązań wodorowych. Symulacje dynamiki molekularnej Li i in. wykazały, że wiązania H są preferencyjnie tworzone przez grupy hydroksylowe, eterowe i amidowe HA. Jednakże, ze względu na najmniejsze przeszkody steryczne, tlen hydroksylowy przy grupie metylenowej (−CH2−OH) jest najczęściej donatorem atomu wodoru. Akceptorem są głównie atomy tlenu grupy fosforanowej DPPC, ale także atomy tlenu grup karbonylowych (>C=O) znajdujące się na łańcuchach acylowych. W naszych badaniach, gdy monowarstwa jest rozszerzona (przy dużych obszarach na cząsteczkę), interakcje hydrofobowe grup >CH2 i −CH3 między HA i DPPC mogą być ważniejsze. Jednakże podczas kompresji, gdy cząsteczki DPPC stają się pionowe, kierując swoje łańcuchy w stronę powietrza, HA może być częściowo wypychany z monowarstwy, akumulując się w regionie grupy głowowej. W takim przypadku przyczyniają się zarówno wiązania wodorowe, jak i siły elektrostatyczne. Ujemnie naładowane grupy HA łatwo oddziałują z dodatnio naładowanymi grupami choliny DPPC wystawionymi w kierunku subfazy, zmieniając tym samym orientację grup fosforocholinowych na bardziej pionową. Powoduje to zmniejszenie obszaru na cząsteczkę w monowarstwie DPPC i przesunięcie izotermy kompresji π−A w lewo w stosunku do DPPC/W i DPPC/AA. Po drugie, HA może tworzyć większe agregaty niż Ch, a zatem dostęp do hydrofobowych łańcuchów fosfolipidowych w skondensowanych monowarstwach jest trudniejszy.

Zgodnie z badaniami Pavinatto i in., chitozan adsorbuje się na interfejsie, powodując rozszerzenie monowarstwy DPPC poprzez oddziaływanie za pośrednictwem sił elektrostatycznych i hydrofobowych. Te ostatnie prowadzą do włączenia chitozanu do hydrofobowych ogonów fosfolipidu. Przy kompresji chitozan jest stopniowo wypychany z monowarstwy, ale nawet przy wysokich ciśnieniach powierzchniowych (na małych obszarach) pozostaje na interfejsie, tworząc warstwę podpowierzchniową. Jest to głównie zapewnione przez interakcje elektrostatyczne z grupami głowymi DPPC, co czyni monowarstwę bardziej elastyczną, o czym świadczy zmniejszony moduł kompresji.

Jak wykazano powyżej, zmiany w strukturze i upakowaniu monowarstwy DPPC, które nastąpiły podczas jej kontaktu z mieszaną subfazą Ch-HA, są większe niż te wywołane przez poszczególne składniki. Biorąc pod uwagę wszystkie badane właściwości fizykochemiczne, ten efekt synergiczny przejawia się wyższymi wartościami A0, Alim, πc i πpt oraz niższymi wartościami CS−1. W warunkach eksperymentalnych (pH 3,3-3,5), chitozan jest dodatnio naładowany (pKa 6,1-6,5), kwas hialuronowy – ujemnie naładowany (pKa 3,0), DPPC – zwitterjonowy, a NAP – neutralny (pKa 4,57). Jak wspomniano wcześniej, Ch i HA są dwoma przeciwnie naładowanymi makrocząsteczkami; mogą samoorganizować się w kompleksy polielektrolitowe Ch-HA po zmieszaniu ze względu na elektrostatyczne interakcje polianion-polikation utrzymywane między grupami amonowymi chitozanu i grupami karboksylanowymi HA. Ponadto, oba polisacharydy są zdolne do oddziaływania poprzez międzyłańcuchowe wiązania H i interakcje hydrofobowe obejmujące odpowiednio grupy hydroksylowe i szkielet węglowodorowy. Te nieelektrostatyczne siły międzycząsteczkowe stają się ważniejsze po wzajemnej neutralizacji polisacharydów (redukcja odpychania elektrostatycznego) i mogą nawet dominować w systemach ze zwitterjonowym DPPC i/lub niezjonizowanym NAP.

Ponadto, w obecności NAP, obserwuje się przesunięcie izoterm π−A dla monowarstwy DPPC do regionu większych obszarów na cząsteczkę na wszystkich subfazach. Niższe wartości CS−1 dowodzą luźniejszego upakowania monowarstwy DPPC-NAP, co wskazuje na penetrację cząsteczek NAP między cząsteczkami DPPC. Zmiany są wzmocnione przez polisacharydy. Ta synergia jest głównie związana ze specyficznymi interakcjami; dlatego składniki subfazy penetrują monowarstwę i pozostają tam, nawet gdy jest ona ściśle upakowana.

Zgodnie z wynikami FTIR-ATR uzyskanymi przez Manrique-Moreno i in., naproksen jest zlokalizowany preferencyjnie w polarnych grupach głowowych fosfolipidów, blisko regionu fosforanowego. Interakcje poprzez grupy karbonylowe i aminowe dla fosfatydylocholiny-naproksenu (PC-NAP) są praktycznie niemożliwe. To rzuca światło na nasze odkrycia. Możemy założyć, że grupa karboksylowa leku znajduje się w pobliżu regionu fosforanowego DPPC, oddziałując poprzez wiązanie wodorowe O–H–O, które jest konkurencyjne dla tworzenia wiązań wodorowych z cząsteczkami wody powłoki hydratacyjnej. Przyciąganie van der Waalsa między łańcuchami węglowodorowymi DPPC jest osłabione, a zatem łańcuchy acylowe są bardziej narażone na interfejs polarno-apolarny. W takiej sytuacji pierścienie aromatyczne neutralnych cząsteczek NAP są najprawdopodobniej wstawione do regionu łańcucha acylowego monowarstwy DPPC, oddziałując poprzez siły hydrofobowe.

W związku z tym można sobie wyobrazić, że duże grupy aromatyczne NAP mogłyby działać jako przeszkoda steryczna. Lek powoduje wyraźne upłynnienie błony z powodu zmian w gęstości upakowania w regionie łańcucha acylowego, regionie grupy głowowej i cząsteczek wody związanych z powierzchnią. Poprawiając płynność modeli błonowych, NAP może zwiększyć ich przepuszczalność, jak donosi Pereira-Leite i in. NAP będący lekiem na ból, stan zapalny i gorączkę, aby osiągnąć swój cel, enzym cyklooksygenazę, musi dyfundować przez błony komórkowe, co może zakłócać właściwości błony. Polisacharydy są zdolne do oddziaływania z błonami komórkowymi, aby osłabić ściśle sprzężone działanie bariery i pomóc w ładowaniu leków przez błonę komórkową. Stąd polisacharydy promujące przepuszczalność błony mogą pozwolić na lepszą penetrację leku w celu wzmocnienia efektu terapeutycznego. Innymi słowy, stabilna, a jednak elastyczna błona, która dzięki dodaniu polisacharydów pozwala lekowi swobodnie przepływać, daje nadzieję na skuteczne działanie przeciwzapalne przy jednoczesnym uniknięciu skutków ubocznych (np. uszkodzeń błony śluzowej żołądka).

Zmiany w powłoce hydratacyjnej pełnią znaczącą funkcję w stabilności błony. Izotermy adsorpcji wykonane przy ciśnieniu powierzchniowym 30 mN/m wskazywały na wysoką stabilność monowarstw DPPC zarówno w procesie relaksacji, jak i pod wpływem stałej siły zewnętrznej. Prawdopodobne jest, że wiązania wodorowe tworzone między cząsteczkami DPPC-NAP-polisacharyd przyczyniają się głównie do stabilności struktury błony, kompensując utracone wiązania wodorowe z wodą, gdy cząsteczki naproksenu i/lub polisacharydu znajdują się w bliskiej odległości od powierzchni monowarstwy DPPC. Ponadto, siły hydrofobowe wydają się być istotne dla tego typu asocjacji. W związku z tym silne interakcje między polisacharydami, NAP i DPPC sugerują, że NAP może być dobrym kandydatem do celowanego dostarczania leków do miejsc bólu z matrycy polisacharydowej, unikając jednocześnie bezpośrednich lokalnych interakcji z wyściółką żołądka. Dodatkowo, właściwości fizykochemiczne polisacharydów uzupełniają się w tym aspekcie: są przeciwbakteryjne, hydrofilowe i mają zdolność utrzymywania odpowiedniego nawilżenia rany przy jednoczesnym absorbowaniu wysięku. Stosując te składniki indywidualnie, takie korzyści nie byłyby możliwe.

NAP i/lub polisacharydy (Ch, HA, Ch-HA) okazały się wpływać na monowarstwy Langmuira DPPC, stosowane tutaj jako uproszczony model błony. Efekt ujawnił się poprzez przesunięcie izoterm π−A i zwiększenie elastyczności monowarstwy. Morfologia powierzchni (obrazy BAM) pokazała, że wstawienie dodatkowych składników do subfazy i/lub interfejsu opóźniało tworzenie fazy skondensowanej poprzez utrudnianie pionizacji cząsteczek DPPC. Co ciekawe, mieszanina polisacharydów (Ch-HA) miała silniejszy wpływ niż każdy z polisacharydów osobno. Efekt upłynnienia polisacharydów, szczególnie zauważalny dla Ch i HA używanych jednocześnie, był wzmocniony w obecności naproksenu. Taki synergistyczny efekt można przypisać bardziej rozległym interakcjom w regionie grupy głowowej DPPC, obejmującym również tworzenie zwiększonej liczby wiązań wodorowych z cząsteczkami wody, co sprawia, że monowarstwa jest bardziej rozszerzona. Zmiany w powłoce hydratacyjnej pełnią znaczącą funkcję w stabilności błony. Dodatkowo, przeciwnie naładowane Ch i HA mogą asocjować w kompleksach polielektrolitowych, potencjalnie zajmując większe obszary niż Ch i HA indywidualnie, przyczyniając się tym samym do większego rozszerzenia monowarstwy DPPC. Te typy elastycznych kompleksów zwiększają przepuszczalność błon komórkowych, co może prowadzić do lepszej penetracji leku i wzmocnionego efektu terapeutycznego.

Naszym zdaniem, przeprowadzone badania dostarczają istotnych informacji na temat zachowania modeli błonowych z wbudowanym naproksenem w środowisku polisacharydowym na poziomie molekularnym i znacząco ułatwiają zrozumienie całego złożonego procesu interakcji w systemie błona-lek-polisacharyd w wielu konkretnych zastosowaniach.

Podsumowanie

Badania wykazały, że połączenie chitozanu i kwasu hialuronowego w hydrożelowych opatrunkach na rany wykazuje efekt synergistyczny, zwiększając ich skuteczność terapeutyczną. Polisacharydy te wpływają na właściwości fizykochemiczne błon komórkowych, zwiększając ich przepuszczalność i ułatwiając przenikanie leków przeciwzapalnych, takich jak naproksen. Chitozan wykazuje działanie przeciwbakteryjne i hemostatyczne, podczas gdy kwas hialuronowy zapewnia odpowiednie nawilżenie rany i absorpcję wysięku. Kompleksy polisacharydowe tworzą elastyczną sieć umożliwiającą kontrolowane uwalnianie leku, co może zwiększyć skuteczność terapii przeciwzapalnej przy jednoczesnym zmniejszeniu działań niepożądanych. Badania na modelowych błonach komórkowych potwierdziły stabilność takich układów i ich potencjał w nowoczesnych systemach dostarczania leków.